Основные методы лабораторной диагностики хламидийной инфекции кошек
Гончаров С.Б.
Ветеринарный врач
В последнее десятилетие интерес медицинских и ветеринарных специалистов многих
стран мира привлекают хламидии, которые широко распространены среди различных
видов животных, что обусловлено наличием неконтролируемого резервуара
возбудителя инфекции в природе.[6] Хламидии способны вызвать заболевание более
чем у 200 видов млекопитающих, а также у птиц и рептилий. Зараженные животные
могут стать источником инфекции человека.[10, 24] Таким образом, хламидиоз
является зооантропонозом, т.е. инфекционной болезнью общей для человека и
животных.
Патология, вызываемая хламидиями, довольно разнообразна. У птиц встречаются
респираторная, энтеральная и генерализованная формы.[15] У млекопитающих
заболевания проявляются в виде энзоотических абортов, плацентитов, вагинитов и
полиартритов.[3, 31] У человека эти микроорганизмы вызывают более 20 клинических
синдромов, в частности, фарингиты, отиты, бронхопневмонии, миокардиты, артриты,
поражение нервной системы и глаз, а также венерические гранулемы и
урогенитальные поражения.[5, 6, 7, 8] Исследования, проведенные во многих
странах в течение последних десяти лет, показали, что среди домашних животных –
хламидиоз, в клинически выраженной форме, чаще всего встречается у кошек.[16,
17]
Возбудители болезни – Chlamydophila psittaci и Chlamydophila felis. Они
относятся к одной из малоизученных групп микроорганизмов. Особенностью хламидий
является способность при неблагоприятных условиях (некорректная терапия, и пр.)
трансформироваться в латентные (L) формы, что сопровождается длительной
персистенцией возбудителя и хроническим течением болезни. Это создаёт серьёзные
трудности в диагностике и лечении заболевания, так как L-формы хламидий не
чувствительны к антибиотикам и трудно диагностируются.[22] В латентной форме эти
возбудители очень устойчивы к химическим и физическим воздействиям, в активной
форме на них губительно действуют УФЛ, кипячение, 700C этиловый спирт и другие
дезинфицирующие средства.[14, 20, 43]
Часто опасность заражения человека хламидиозом исходит от птиц, в особенности от
попугаев и голубей.
В 1980-м году были описаны 20 случаев заражения человека хламидиями от млекопитающих. Кошки заражаются почти всеми штаммами возбудителя. Птицы и мыши, на которых они охотятся, являются природным резервуаром и первичным источником инфекции. Заражение человека происходит при тесном контакте с кошкой, у которой инфекция может протекать латентно.[33]
Этиологическая роль кошачьих хламидий пока до конца не выяснена, хотя в литературе имеются примеры зооантропонозной природы этой инфекций. Так, в США двадцатилетний мужчина заболел односторонним фолликулярным конъюнктивитом после того, как у его кошки проявились симптомы поражения конъюнктивы. Как у кошки, так и у её хозяина в конъюнктивальных мазках, взятых в этих случаях, были найдены тельца-включения, типичные для хламидий. Полагают, что антиген от кошки к человеку попал через нанесенные кошачьи царапины.[2]
В соответствии с решением юридической комиссии Международной ассоциации микробиологических обществ (МАМО), с 1980г. эти микроорганизмы получили родовое название Chlamydia. До 1989г. были известны только 2 вида хламидий - C.trachomatis и C.psittaci. С 1989г. выделяют третий самостоятельный вид хламидий - C.pneumoniae, а в 1993г. японскими микробиологами описан и четвертый вид - C.pecorum (Fukushi Н., Hirai К., 1993). По новой классификации речь идет о патогенных для человека микроорганизмах Chlamydia trachomatis, серовары D-K, принадлежащих в роду Chlamidia. К этому же роду относится также вид C.muridarum, патогенный для мышей и хомячков, и вид C.suis, инфицирующий свиней.[24, 33]
Хламидии являются грамотрицательными бактериями. Они имеют сходную с бактериями клеточную стенку, их генетический аппарат представлен нуклеиновыми кислотами – ДНК и РНК, чувствительны к антибиотикам, что сближает их с грамотрицательными бактериями.[32] Однако они не способны размножаться на искусственных питательных средах, и для репродукции им нужна живая чувствительная клетка как внутриклеточным микроорганизмам, что роднит их с вирусами.[41]
Хламидии обладают способностью блокировать механизмы иммунной защиты хозяина путем предотвращение слияния фагосомы с лизосомами. Благодаря этому клетки хозяина не только предохраняют инфект, но и способствуют их росту. Для размножения и роста внутриклеточные патогены используют питательные вещества и продукты жизнедеятельности клетки-хозяина. В процессе своего размножения хламидии разрушают цитоплазматические включения, выходят из клетки-хозяина во внешнюю среду и заражают новые клетки.[12]
Патогенез хламидийной инфекций может быть представлен в виде следующей схемы: хламидии являются внутриклеточными облигатными паразитами, обладают высоким политропизмом. Проникнув в организм аэрогенным, алиментарным или половым путем, возбудитель первично размножается в эпителиальных клетках слизистых оболочек и макрофагах. Затем внедряется в кровь и заносится практически во все внутренние органы, лимфатические узлы, суставы и даже в головной и спиной мозг.[30]
Естественный цикл развития хламидий проходит в цитоплазматических включениях живых клеток (элементарное тельце ® ретикулярное тельце ® ретикулярные тельца ® промежуточные тельца ® элементарные тельца) и продолжается от двух до трех суток. Элементарные тельца ответственны за процесс прикрепления к клетке-мишени и проникновения в нее. Они устойчивы к факторам окружающей среды. Мелкие и оптически плотные элементарные тельца имеют ригидную клеточную стенку, жесткость структуры которой обеспечивается плотными дисульфидными связями основного белка наружной мембраны и двумя богатыми цистеином белками: белком оболочки и липопротеином наружной мембраны. Ретикулярные тельца – это большие, метаболически активные формы, синтезирующие ДНК, РНК и белки. Ретикулярные тельца являются высоко лабильными формами, которые не способны выжить вне клетки-хозяина.[42]
Хламидии проявляют выраженную чувствительность к действию коротковолновых и длинноволновых ультрафиолетовых лучей и высокой температуры. Элементарные тельца теряют свою инфекционность в 24-36 часов при 370С. Концентрированная суспензия хламидий инактивируется в течение 1 мин. при 95-1000С, через 10-15 мин. при 700С, через 30 мин. при 500С.
Установлена возможность сохранения инфекционности материала на хлопчатобумажных тканях до 2 суток при 18-190С.
Хламидии на стадии ретикулярных телец высокочувствительны к действию 70% этанола, 2% раствор лизола, 0,05% раствора нитрата серебра, 0,1% раствора йодида калия, 0,1% раствора перманганата калия, перекиси водорода, этилового эфира и инактивируются при комнатной температуре в течение 2 суток.[35]
Активная форма хламидиоза кошек – высококонтагиозная полисимтоматическая болезнь, проявляющаяся, чаще всего, общей слабостью, скованностью движений, повышенной температурой тела, конъюнктивитом, ринитом, отдышкой, гастритом, эндометритом, вагинитом. Реже встречаются поражения других органов и систем. При урогенитальной локализации хламидии вызывают аборты, мертворождения и бесплодие. Хламидиоз наиболее часто поражает котят в возрасте от 5-ти недель до 9-ти месяцев. Взрослые животные также могут заражаться, поскольку естественный иммунитет не продолжителен, имеет не высокую напряженность. Велика вероятность повторного заражения, так как гуморальные антитела, циркулирующие в крови, не могут защитить организм от реинфекции.[16]
Инкубационный период длится от 5 до 10 дней. В начале заболевания обычно отмечают легкую лихорадку, длящуюся несколько дней. Заболевшие кошки обычно продолжают принимать корм и, как правило, чувствуют себя хорошо, проявляя лишь конъюнктивальный дискомфорт. Конъюнктивит начинается в большинстве случаев унилатерально (односторонне), выделение из глаза – серозные. Через 10 – 17 дней поражается второй глаз. Конъюнктивит может продолжаться от нескольких дней до нескольких месяцев, а иногда принимает хроническое течение. По мере развития болезни конъюнктива становится более гиперемированной, а выделения – слизисто-гнойными вследствие вторичной бактериальной инфекции.[38]
Поражение дыхательных путей часто проходит бессимптомно или со слабо выраженными признаками. Поэтому диагностировать хламидиозную пневмонию можно только гистологическими методами. Очаги поражения легочной ткани в виде мелких ограниченных гиперемированных участков со слабой аэрацией, располагаются преимущественно в периферических участках легкого рядом с бронхиолами.
Нарушение репродуктивной функции у кошек, включая аборты, отмечались довольно часто в кошачьих питомниках, где наблюдается эндемическое течение болезни.
Внедрение хламидий в мочеполовой тракт редко сопровождается заметными клиническими проявлениями. Заболевание чаще бывает асимптомным или скрытым.
Диагностика хламидиоза кошек затруднена, поскольку многие клинические признаки присущи другим заболеваниям – калицивирусной и реовирусной инфекциям.[17]
Ни один из современных методов диагностики внутриклеточных патогенов не обеспечивает выявление возбудителя в 100% случаев. Поэтому лабораторная диагностика хламидий должна включать в себя сочетание не менее двух методов (прямых или непрямых).[23]
1. Методы прямого выявления бактерий:
· Микробиологическое исследование – выделение чистой культуры возбудителя;
· Цитологическое исследование мазков, окрашенных по методу Романовского-Гимза;
· Иммунологическое исследование – выявление антигенов возбудителя в мазках с
помощью специфических антител (реакция прямой иммунофлуоресценции – РИФ),
ДНК-зонды;
· Молекулярно-биологические методы – определение специфического участка ДНК/РНК
в геноме возбудителя (полимеразная цепная реакция – ПЦР, лигазная цепная реакция
– ЛЦР);
· Серологическое исследование – определение бактериальных антигенов
(иммуноферментный анализ – ИФА);
· Методы экспресс-диагностики хламидий (иммунохроматография и
ферментспецифическая реакция).
2. Непрямой метод, косвенно указывающий на наличие возбудителя у пациента:
· Серологическое исследование – определение специфических антител,
образовавшихся в процессе иммунного ответа на микроорганизм (реакция связывание
комплемента – РСК, реакция непрямой иммунофлуоресценции – РНИФ, иммуноферментный
анализ – ИФА, реакция микроиммунофлуоресцинции – МИФ, рекомбинантный
липополисахаридный ИФА – r-ELISA).[1, 18]
Методы прямого выявления хламидий.
Наиболее чувствительным, но трудоемким методом лабораторной диагностики является
микробиологическое исследование.
Для C. psittaci наиболее эффективно применяют перманентную клеточную линию из почек африканской зеленой мартышки (BGM), в то время как для C. trachomatis клетки McCoy.
Критерием диагностического выделения хламидий служит выявление в инфицированных клетках типичных цитоплазматических включений в окрашенных препаратах при первичном заражении или в серии из 1-2 пассажей при отсутствии бактериальной контаминации.
При микробиологическом методе исследования возможно получение ложно-негативных результатов. Это происходит вследствие гибели возбудителя при нарушении правил забора биологического материала или во время его транспортировки в микробиологическую лабораторию.
Цитологический метод – метод непосредственной микроскопии - патологического материала (соскоб с пораженной слизистой оболочки) был основным способом обнаружения хламидий. При этом использовали окраску препаратов по Стемпу, Маккиавелло и Романовскому-Гимзе. Окраска по Стемпу придает элементарным тельцам хламидии красно-фиолетовый цвет на синем фоне препарата; по Маккиавелло хламидии окрашиваются в ярко-красный цвет, клетки патологического материала – в светло-синий, ядра клеток – в темно-синий цвет; по Романовскому-Гимзе элементарные включения хламидии приобретают красно- фиолетовый цвет, а ретикулярные тельца пораженной клетки – синий, ядро клеток – бордово-фиолетовый и их цитоплазма – голубой. Окрашенные мазки исследуют с иммерсионной системой. Клеточные включения при микроскопии находят в виде скопления в цитоплазме вокруг ядра пораженной клетки и образующих компактные включения в форме “ шапочки жандарма”. Включения могут располагаться в цитоплазме клетки диффузно. Цитологический метод в последнее время практически не используется, в связи с низкой чувствительностью – диагностировать хламидийную инфекцию у больных животных удается лишь в 10-12% случаев.[18]
Одним из самых распространенных методов диагностики является метод иммунофлуоресценции, позволяющие выявить цитоплазматические включения хламидий с содержащимися в них антигенами.
Прямой метод иммунофлуоресценции основан на выявлении хламидийных антигенов в клинических образцах от животных с помощью лиофилизированных моноклональных антихламидийных иммуноглобулинов, меченных флуоресцин-изотиоционатом (ФИТЦ), с синькой Эванса и азидом натрия.
Высокая специфичность моноклональных антител позволяет диагностировать наличие элементарных телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые образования с ровными краями округлой формы. Размеры их составляют 1/100 от окружающих эпителиальных клеток.
В непрямом методе предусматривается непрямое окрашивания антигена, который соединяется на первом этапе реакции с немеченой антисывороткой животного, заведомо содержащей хламидийные антитела, а на втором этапе проводится окрашивание образовавшегося комплекса антиген-антитело за счет добавления меченной (антивидовой) сывороткой, содержащей конъюгированные с ФИТЦ антитела к глобулинам (антигенам) сыворотки, использовавшейся на первом этапе.
Получение ложно-негативных материалов может быть связано с нарушении правил забора биологического материала (отсутствие эпителиальных клеток в мазке). Ложно-позитивные результаты являются следствием неспецифического связывания антител с неинфекционным биоматериалом.
Метод полимеразной цепной реакций (polimerase chain reaction, PCR, ПЦР) или реакция энзиматической амплификаций, предложенная Кэри Б. Мюллисом (1983), стремительно вошел в практику и работу ученых, ведущих исследования в области биологии и медицины. ПЦР широко применяется для диагностики и типирования возбудителей хламидиозов, что связано со сложностью их культивирования.[19]
Достоинства ПЦР:
а) Быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при параллельной обработки 10-12 образцов;
б) Надежность;
в) Чувствительность;
г) Специфичность;
д) Для ПЦР пригоден любой материал, даже гистопрепараты.
Основные компоненты ПЦР:
а) термостабильный фермент ДНК-полимера;
б) пара олигонуклеотидных праймеров;
в) четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов;
г) копируемая ДНК;
д) ионы Mg2+ необходимые для функционирования ДНК-полимеразы;
е) буферные растворы для поддержания рН во время ПЦР между 6,8 – 7,8 и минеральное масло для предотвращение испарения.
Амплификатор – это прибор для проведения реакции в автоматическом режиме, обеспечивающем поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени.
Технология идентификации ДНК-содержащих вирусов заключается в следующем:
1) Из исследуемого материала выделяется ДНК-матрица
2) В пробирке смешивают ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимеразу
3) Пробирку со смесью нагревают до температуры денатурации ДНК (940С), при этом две цепи ДНК расходятся
4) Затем пробу инкубируют при температуре гибридизации праймеров с ДНК-матрицей (40-600С) в последующем
5) ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (720С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала
6) В последующем цикле синтез осуществляется с 4 копий, далее с 8 и т. д., до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови.
Индикация амплифицированного генетического материала проводится выше изложенным способом. В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации.[34]
Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами. Для этого необходимо использовать чистые перчатки, одноразовые пробирки и наконечники к автоматическим пипеткам, УФЛ и 700C спирт для обработки помещений и рабочих поверхностей столов и приборов.[13]
Несмотря на растущую популярность метода ПЦР он также, как и ПИФ небезупречен, поскольку при использовании высокочувствительной и специфичной ПЦР не исключены ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Если C. psittaci обнаружена методом ПЦР, то можно ограничится только этим исследованием. Мнение, что ПЦР даже при соблюдении всех технологических требований дает ложноположительные результаты вследствие контаминации в лаборатории, не подтверждается практикой, хотя были случаи, когда ПЦР давала положительный результат, а ПИФ – отрицательный. Именно такие случаи относятся к ситуациям так называемого «субъективного характера учета результатов», полученных методом иммунофлуоресценции.
Для обнаружения в исследуемом материале хламидий можно применить иммуноэнзимный метод (ELISA). При этом используют антитела, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.). При наличии в исследуемом материале хламидий, то есть положительная реакция антиген-антитело, высвобождается фермент, который действует на специально вводимый в реагирующую смесь субстрат. Образуется цветное соединение и по интенсивности цвета, определяемого с помощью спектрофотометра, судят о количестве и наличии антигена в забранном материале (мазке, соскобе). Иммуноэнзимный анализ, как и реакция прямой иммунофлуоресценции, может дать положительный результат при наличии в забранном материале нежизнеспособных хламидий, а также других бактерий, имеющих перекрестно реагирующие антигены (некоторые грамотрицательные бактерии, риккетсии Провачека и др.). Ложно-негативные результаты являются следствием низкой концентрации антигена в исследуемых образцах. Причиной ложно-позитивных результатов может быть неспецифическое связывание антител с неинфекционным биоматериалом.[18, 34]
Методы непрямого выявления хламидий.
Эта группа методов позволяет избежать ложноотрицательных результатов при прямых методах и позволяет в ряде случаев определить стадию и характер течения заболевания. Это особенно важно при персистирующей инфекции, которая поддерживает хроническое течение на протяжении многих месяцев, повреждая и разрушая ткани и органы. Методы непрямого выявления бактерий особенно хороши, если возникают трудности при взятии материала для обнаружения антител.
В основе всех этих методов лежит выявление специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови и секретах инфицированного организма, в процессе иммунного ответа на внедрение возбудителя инфекционного заболевания. Антитела относятся к трем классам иммуноглобулинов: M, G и A. Накопление антител каждого из этих классов происходит через разные промежутки времени от начала иммунного ответа и зависит от характера инфицирования (первичное или повторное) [1, 6].
Регистрацию специфических антител можно проводить одним из иммунохимических методов. Наиболее эффективным являются методы микроиммунофлуоресцинции и рекомбинантного липополисахаридного ИФА, которые не требуют большого количества биологического материала и позволяют достаточно точно определить к какому классу относятся антитела. С помощью этих методов удается установить серологические критерии и стадии заболеваний.
Отрицательный результат серологического исследования не позволяет однозначно исключить хламидиоз, так как кроме серопозитивных встречаются и серонегативные формы этой инфекции. Выявление в крови только IgG к C. psittaci даже в высоком титре при отсутствии маркеров самого возбудителя в урогенитальном тракте не является основанием для установления диагноза. И наоборот, обнаружение IgA к C. psittaci – основание для постановки диагноза хламидиоза. Принципиального значения величина титра этих антител (IgA) и наличие или отсутствие маркеров самих хламидий в урогенитальном тракте не имеет.[18,19,39]
Комментарии