Морфо-функциональное состояние семенников при криоконсервации на фоне криопротекции глицерином и смесью биофлаваноидов

Т.М. Касымбеков, Ашимов Ж.И., Салибаев О.А.
Национальный хирургический центр, г. Бишкек, Кыргызская Республика

Необходимо отметить, что до настоящего времени не существует универсальных принципов подбора или синтеза криопротектора с заданными, по отношению к биологическому объекту, свойствами.

Цель работы. Выполнить оценку степени жизнеспособности криоконсервированной тестикулярной ткани на фоне криопротекции глицерином и смесью биофлавоноидов.

Материал и этапы исследования. Эксперименты проведены на 10-ти половозрелых беспородных собаках-самцах массой 7-14 кг, содержащихся на обычной диете вивария. Эксперименты на животных выполнены в соответствии с международными требованиями гуманного отношения к экспериментальным животным (адекватный уход, кормление, наркоз, гуманное выведение из опыта).

Нами использован гистостереометрический анализ. Семенники помещали в фиксирующую жидкость - 10% нейтральный формалин. Тестикулярную ткань рассекали на пластины во фронтальной плоскости, из которых после обычной парафиновой проводки нарезали серийные срезы и окрашивали гематоксилин - эозином.

С помощью винтового окуляр - микрометра МОВ-1-15х, (цена 1 деления при увеличении объектив 40 окуляр 10 составила 0,67 мкм), вмонтированного в тубус светового микроскопа Биолам ЛОМО и окулярной планиметрической сетки, состоящей из 245 тестовых точек, проводили гистостереометрический анализ семенников по следующим параметрам: 1) площадь (S мм2) поперечного сечения канальца; 2) толщина (Т мм) слоя герминативных клеток; 3) индекс сперматогенеза (IS); 4) диаметр (Ǿ мкм), площадь поперечного сечения (S мкм2), объем (V мкм3) ядер герминативных клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды), а также клеток Лейдига и Сертоли.

Таблица 1. Содержание и физико-химические характеристики смеси флавоноидов

Показатели

Исходные данные

После  обработки

Структура

Плотная, в изломе неоднородная

Жидкость

Консистенция

Вязкая – при 20-40°, твердая – ниже 20°С

Легкоподвижная

Окисляемость, сек.

21,0

20,0

Масса доли воска, %

23,0

10,3

Масса доли механических примесей, %

18%

Не определяется

Масса доли флавоноидных  соединений, %

22%

35,6

Йодное число, %

35

38

Кол-во окисляемых в-в в 1 см3 р-ра окислителя на 1 мг основного в-ва.

0,5

0,4

Находим нужным, привести авторскую пропись приготовления препарата для криоконсервирования (табл.1): 50 грамм propolis растворяется в 200 мл этилового спирта.

После чего раствор пропускается через бумажный фильтр. В полученном растворе вновь растворяется 50 гр. рropolis. В общей сложности, эту процедуру повторяют трижды.

Конечный продукт подвергается выпариванию, а сухой остаток растворяется в дистиллированной воде. В итоге, конечная концентрация флавоноидных и других фенольных соединений, по мнению авторов, возрастает до 36,7%. В этом случае доля воска и количества окисленных веществ уменьшается, а йодного числа остается на прежнем уровне.

Полученные результаты и их обсуждение. При морфометрии семенников криоконсервированных на фоне глицерина диаметр и площадь поперечного сечения соответствуют исходным значениям и составляют 0,145 ,003 мм и 0,02 0,0007 мм2. Толщина слоя герминативных клеток по сравнению с нормой снижена в 1,7 раза и составила 0,05 0,002 мм. Индекс сперматогенеза был недостоверно выше исходного значения и составил 4,02.

В отношении герминативных клеток следует отметить, что итоговые данные морфометрического исследования сперматогонии, сперматоцитов и сперматид недостоверно отличались от исходных значений. Так, диаметр ядер сперматогонии был равен 4,8 0,11 мкм, сперматоцитов - 7,2 0,14 мкм, сперматид - 11,05 0,6 мкм.

Площадь поперечного сечения ядер сперматогонии составил 18,9 0,9 мкм2, сперматоцитов - 41,6 1,8 мкм2, сперматид - 11,05 0,6 мкм2 . Объем ядер сперматогонии составил 65,1 4,7 мкм3, сперматоцитов - 211,2 14,8 мкм3, сперматид - 28,9 2,6 мкм3 (рис. 4). В целом, такая морфометрическая картина характеризует сохранность сперматогенных клеток под воздействием глицерина по сравнению с группой, где криоконсервация проводилась без криопротектора.

Такая же сохранная морфометрическая картина отмечена и для клеток Сертоли. Диаметр ядер этих клеток составил значение близкое к исходному - 6,1 0,09 мкм. Площадь поперечного сечения ядер равна 30,7 1,0 мкм2, а объем ядер клеток составил 132,8 6,7 мкм3. Напротив, для клеток Лейдига было характерно недостоверное повышение изучаемых показателей. Так, диаметр ядер составил 5,9 0,1 мкм. Площадь поперечного сечения ядер равнялась 28,5 1,3 мкм2, а объем ядер - 118,7 8,5 мкм3.

Таким образом, в данной группе исследований можно утверждать о сохранности структурных компонентов тестикулярного трансплантата от криогенных повреждений при использовании в качестве криопротектора 10% раствора глицерина.

При использовании в качестве криопротектора смеси биофлавоноидов морфометрические показатели состояния семенных канальцев были следующими: диаметр канальца был равен 0,16 0,0016 мм, а площадь поперечного сечения канальца равнялась 0,02 0,0004 мм2, что не достоверно отличало эти показатели от значений исходной величины и при использовании раствора глицерина.

Однако, в отличие от сравниваемых групп толщина слоя герминативных клеток была достоверно меньше в случае с нормой и составила 0,037 0,011 мм. Индекс сперматогенеза был также снижен и составил 3,13.

При исследовании сперматогенных клеток количественные показатели в данной группе не достоверно отличались от данных, где применялся глицерин. Для сперматогонии диаметр ядер составил 4,9 0,06 мкм, сперматоцитов - 6,7 0,07 мкм и сперматид - 3,8 0,06 мкм. Площадь поперечного сечения сперматогонии составила 19,5 0,6 мкм2, сперматоцитов - 35,6 0,8 мкм2, сперматид - 11,6 0,3 мкм2 .

Объем ядер сперматогонии был равен 68,05 2,9 мкм3, сперматоцитов - 163,2 5,8 мкм3, сперматид - 21,5 1,3 мкм3 . Количественные показатели поддерживающих клеток Сертоли были выше значений опытной группы, где применялся глицерин, и соответствовали исходным значениям. Так, диаметр ядер был равен 6,6 0,07 мкм, площадь поперечного сечения составила 35,1 0,7 мкм2, а объем ядер клеток - 159,4 5,1 мкм3.

Вывод. Использование в качестве криопротектора смеси биофлавоноидов позволяет достигнуть сохранности структурных образований семенника, не уступающей апробированному криопротектору глицерину. В частности, интерстициальный отек выражен в меньшей степени, чем при криопротекции глицерином. Примечательно то, что при использовании указанного криопротектора зрелые сперматозоиды встречаются во всех канальцах, в достаточном количестве и с сохраненной центробежной ориентацией.