Изучение возможности использования электроретинографии для оценки фармакокинетики лекарственных препаратов, оказывающих ретинопротекторное действие

Т.В. Ставицкая
Кафедра глазных болезней лечебного факультета РГМУ

Study of possibilities of usage of electroretinography for evaluation of pharmacokinetics of drugs with retinoprotective effect
T.V. Stavitskaya

Author of the article explored the possibility of usage of electroretinography for evaluation of peculiarities of the pharmacokinetics of neuroretinoprotectors. 2 drugs with neuroprotective effect– betaxolol and retinalamin, were chosen for analysis. The investigation was performed on the 22 chinchilla rabbits (44 eyes) with the weight of 3 kg. Pharmacokinetics of betaxolol was evaluated with the help of HPLC. When comparing data of HPLC and ERG on the background of circular hypoxia of retina tissues, the correlation between cumulation time and increasing of electrical retinal activity (in 60–90 minutes after drug usage) was detected. These data allowed the author, taking into consideration the dynamics of ERG, to suggest that retinalamin was slowly cumulating in the retina and the maximum of it’s concentration was reached in 120–150 minutes after parabulbar injection. T 1/2 was near 3,5–4 hours.

Используемые методы анализа распределения лекарственного препарата в тканях глаза во многом соответствуют тем методам, которые применяются в системной фармакокинетике.

Наиболее широко применяемый для анализа кинетики глазных препаратов метод состоит в использовании флуоресцирующих веществ в качестве индикаторов, что позволяет произвести замер концентрации во всех прозрачных средах живого глаза человека или животного с помощью специального прибора – флюрометра. Используя радиоизотопные вещества или высокоэффективную жидкостную или газовую хроматографию также можно измерить концентрацию лекарственных препаратов в различных тканях. Эти методы позволяют более точно замерить концентрацию вещества, однако, как правило, требуется забор биологического материала (жидкости или ткани), что возможно только при проведении хирургического вмешательства.

Поэтому эти исследования чаще проводятся у экспериментальных животных. У человека измерение концентраций препарата в тканях и жидкостях глаза могут быть проведены после энуклеации, а также возможно исследование образцов внутриглазной жидкости, полученной у пациентов во время проведения полостной операции. Однако в ряде случаев, если в состав препарата входят вещества, присутствующие в тканях человека и животных, провести фармакокинетический анализ традиционными способами невозможно.

Чтобы уменьшить травматичность проводимых фармакокинетических исследований, было предложено использовать биологическую реакцию глаза на активные компоненты препарата для оценки особенностей их распространения в различных тканях глаза (Levy, 1964; Schoenwald and Smolen, 1971; Yoshida and Mishima, 1975; Mishima, 1981; Ohara, 1977).

Обычные фармакокинетические модели описывают концентрацию препарата, как функцию дозы и времени. В противоположность им фармакодинамические модели независимы от времени и отражают связь между концентрацией и эффектом.

Так как фармакологический эффект воздействия препарата на организм количественно зависит от введенной дозы, то кривая биологической реакции может отражать поведение кривой изменения концентрации лекарства в тканях. Таким образом, фармакокинетика данного лекарства может быть проанализирована на основании биологической реакции, которую оно вызывает.

Осуществить данный анализ возможно при соблюдении некоторых условий:

– точная связь доза–реакция может быть получена при использовании изолированных образцов тканей;

– доступны методы точного измерения эффекта «на живом организме»;

– могут быть подвергнуты сравнению связь «доза–реакция», полученные как in vitro, так и in vivo.

Для фармакокинетического анализа подходит реакция внутриглазных мышц – миоз, мидриаз, циклоплегия. Также может быть использована динамика внутриглазного давления или чувствительности роговицы, так как эти параметры можно измерить in vivo. Перспективным является использование электроретинографии, а также моделей хронического воспаления сосудистой оболочки для анализа кинетики препаратов.

Целью исследования было изучение возможности использования электроретинографии для оценки особенностей фармакокинетики нейроретинопротекторов. Для анализа были выбраны два препарата, оказывающих прямое нейропротекторное действие – бетаксолол и ретиналамин. Выбор препаратов был обусловлен тем фактом, что изучение особенностей глазной фармакокинетики бетаксолола можно провести традиционным способом, в то время как для ретиналамина это невозможно, поскольку содержащиеся в нем полипептиды присутствуют в сетчатке человека.

Материалы и методы. Исследование было проведено в два этапа.

Вначале были выявлены особенности распространения в тканях сетчатки бетаксолола с помощью традиционных методов фармакокинетического анализа. Исследование проведено у 12 кроликов (24 глаза) породы «Шиншилла» весом 3 кг. Перед исследованием всем кроликам в оба глаза закапывали 1 каплю 0,5% раствора бетаксолола. Далее кролики были распределены на четыре одинаковые группы в соответствии со сроками забоя. Забой производился через 30, 60, 120, 240 минут. После забоя глазные яблоки удалялись. Далее глазные яблоки замораживали при температуре –70°С, для чего их опускали в емкость с жидким азотом на 2–3 минуты. После заморозки производили последовательное выделение роговицы, влаги передней камеры, радужки и цилиарного тела, хрусталика, стекловидного тела и сетчатки. До проведения анализа биопробы хранили при температуре – 20°С в ёмкости с сухим льдом. Далее с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в ее обращеннофазовом варианте проводили анализ полученных биопроб.

Использовался хроматограф, включающий в себя два градиентных насоса фирмы Gilson модели 305, смеситель, УФ–детектор Linear 1000 с переменной длиной волны. Контроль за прибором и анализ полученных хроматограмм осуществляли с использованием программы.

При анализе использовалась предколонка размером 4 на 10 мм, заполненная сорбентом. Объем вводимой пробы составлял 20 мкл.

Анализ глазной жидкости и стекловидного тела проводился непосредственно. При анализе остальных тканей к предварительно взвешенному образцу ткани добавляли 0,200 мл бидистиллированной воды, измельчали и проводили экстракцию в ультразвуковой ванне в течение 2 часов. Полученный раствор отделяли и анализировали.

Качественный анализ проводили по времени удерживания препарата. Количественный анализ проводили методом абсолютной калибровки с использованием фактора отклика. Зависимость между площадью пика и величиной концентрации позволила получить с помощью метода наименьших квадратов средний фактор отклика для исследуемого соединения с ошибкой не более 18%. Контроль фактора отклика проводили в процессе анализа следующим образом. К глазной жидкости или экстракту ткани, заведомо не содержащей вводимого вещества, добавляли его точно отмеренное количество. Анализ полученного раствора позволял контролировать отклонение фактора отклика в присутствии белков и иных соединений, содержащихся в растворе.

На втором этапе было проведено изучение динамики электроретинографии на фоне циркуляторной гипоксии тканей сетчатки без использования нейроретинопротекторов и после их применения. Исследование было проведено у 10 кроликов (20 глаз) породы «Шиншилла» весом 3 кг. Модель циркуляторной гипоксии создавали путем наложения двух лигатур на обе общие сонные артерии.

Общая электроретинограмма (ЭРГ) регистрировалась в стандартных условиях с использованием ганцфельд–стимуляции с помощью программы, разработанной фирмой «МБН». Регистрация ЭРГ осуществлялась до перевязки общих сонных артерий и далее каждые 30 минут в течение 5 часов.

В ходе исследования животные были разделены на 3 группы: 1 группа (контроль) включала 4 кролика (8 глаз), у которых исследовалась динамика электроретинограммы на фоне циркуляторной гипоксии тканей сетчатки без использования нейроретинопротекторов.

Во второй группе (3 кролика, 6 глаз) изменение показателей общей ЭРГ оценивалось на фоне применения бетаксолола. Так как к моменту проведения этого этапа исследования данные о накоплении препарата в тканях сетчатки были получены, препарат применялся дважды с интервалом 2 часа по 1 капле 0,5% раствора в каждый глаз (до перевязки сосуда и через 120 минут после начала эксперимента).

В третьей группе животных (3 кролика, 6 глаз) использовали раствор ретиналамина, который вводили парабульбарно однократно перед перевязкой сосудов в объёме 0,3 мл.

Результаты и обсуждение. При анализе пенетрации бетаксолола в роговицу было выявлено, что максимальная концентрация бетаксолола наблюдалась через 30 и 60 минут и в среднем она была равна 29,43±13,11 мкг/мл и 27,29±12,24 мкг/мл соответственно. Ко второму часу исследования концентрация снизилась практически вдвое и была равна 15,14±7,17 мкг/мл. Через 240 минут количество бетаксолола уменьшилось в 3 раза по сравнению с началом исследования, в среднем концентрация составила 9,0±4,08 мкг/мл. У всех испытуемых распределение бетаксолола было однородным.

Уменьшение концентрации бетаксолола во влаге передней камеры происходило более быстро. Максимальная концентрация бетаксолола наблюдалась через 30 минут и была равна 23,5±1,76 мкг/мл. Через 60 минут концентрация снизилась практически вдвое и была равна 11,7±6,37 мкг/мл. Через 120 и 240 минут количество бетаксолола во влаге передней в среднем составило 8,72±3,9 мкг/мл и 9,8±0,75 мкг/мл. У всех испытуемых распределение бетаксолола было однородным.

Максимально длительное накопление бетаксолола было в ткани радужки и цилиарного тела. Через 30 минут концентрация составила 14,11±7,21 мкг/мл. Максимальная концентрация бетаксолола наблюдалась через 60 и 120 минут и была равна 20,6±13,4 мкг/мл и 27,67±15,16 мкг/мл соответственно. Через 240 минут концентрация бетаксолола в ткани радужки и цилиарного тела была равна исходной и составила 13,29 ± 5,99 мкг/мл.

У всех испытуемых распределение бетаксолола было однородным.

В веществе хрусталика максимальная концентрация бетаксолола наблюдалась через 30 и 60 минут и в среднем она была равна 20,84±11,21 мкг/мл и 22,43±30,86 мкг/мл соответственно. Ко второму часу исследования концентрация снизилась до 14,84±7,88 мкг/мл. Через 240 минут количество бетаксолола, определяемое в веществе хрусталика было незначительным, в среднем концентрация составила 3,14±1,77 мкг/мл. Следует отметить – распределение бетаксолола у испытуемых не было однородным. Наблюдались значительные колебания концентрации бетаксолола в веществе хрусталика через 60 минут после начала исследования.

В стекловидном теле бетаксолол накапливался в незначительном количестве. Через 30 минут концентрация составила 0,9±0,49 мкг/мл. Через час концентрация достигла максимума и составила 7,38±3,39 мкг/мл. Через 120 минут концентрация снизилась вдвое по сравнению с максимальным значением и была равна 3,0±1,38 мкг/мл. Через 240 минут концентрация была практически равна исходной и составила 0,6±0,28 мкг/мл. У всех испытуемых распределение бетаксолола было однородным.

В сетчатке бетаксолол накапливался в значительном количестве. Временные параметры распределения бетаксолоа были следующими. Через 30 минут концентрация была равна 18,2±5,89 мкг/мл. Через 60 минут она несколько увеличилась и составила 22,33±14,81 мкг/мл. Затем она начала снижаться и через 120 и 240 минут была равна 6,57±4,79 мкг/мл и 5,7±2,69 мкг/мл соответственно. Распределение бетаксолола у испытуемых было недостаточно однородным.

Более наглядно распределение бетаксолола в тканях глазного яблока представлено на рисунке 1.

Рис. 1. Концентрация бетаксолола в различных тканях глазного яблока после однократной инстилляции 0,5% раствора.

Анализ динамики общей ЭРГ выявил, что наиболее значимыми и статистически достоверными были изменения амплитуды "в"– волны.

В группе контроля наблюдалось планомерное снижение амплитуды "в"– волны в течение всего периода наблюдения.

Во второй группе животных кривая изменения амплитуды имела совершенно другой вид. Наблюдалось значительное увеличение амплитуды через 1–1,5 часа после применения бетаксолола. При этом отмечалось не только увеличение амплитуды "в"– волны соответственно к 90 и 180 минутам, но и определенная кумуляция эффекта после повторного применения препарата (рис. 2).

Рис. 2. Динамика амплитуды "в"- волны общей ЭРГ на фоне циркуляторной ишемии тканей сетчатки без использования нейроретинопротекторов и после применения бетаксолола.

Анализируя динамику амплитуды "в"–волны в третьей группе животных, обнаружили, что наблюдается увеличение амплитуды анализируемого показателя после первоначального снижения на фоне гипоксии к 150 минуте наблюдения, в дальнейшем показатель вновь снижается. Однако интересным является наличие некоторого увеличения амплитуды "в"–волны к концу наблюдения (270–300 минута исследования). Данный прирост электрической активности сетчатки, по–видимому, обусловлен так называемым эффектом пептидного каскада, возникающего при применении ретиналамина (рис. 3).

Рис. 3. Динамика амплитуды "в"- волны общей ЭРГ на фоне циркуляторной ишемии тканей сетчатки без использования нейроретинопротекторов и после применения ретиналамина.

Сравнивая изменение амплитуды "в"–волны в относительных величинах (рис. 4) у животных трех групп, а также данные накопления и выведения бетаксолола в тканях сетчатки, которые были получены на первом этапе исследования, можно предположить, что ретиналамин накапливается в тканях сетчатки достаточно медленно – максимальная концентрация препарата наблюдается через 120–150 минут после парабульбарного введения. Период полувыведения составляет около 3,5–4 часов.

Рис: 4. Динамика амплитуды "в"- волны общей ЭРГ (в относительных величинах) на фоне циркуляторной ишемии тканей сетчатки без использования нейроретинопротекторов и после применения бетаксолола и ретиналамина.

Выявив соответствие увеличения амплитуды "в" волны общей ЭРГ временным параметрам увеличения концентрации бетаксолола в тканях сетчатки, можно предположить, что ЭРГ может быть использована для оценки особенностей фармакокинетики препаратов, оказывающих нейроретинопротекторное действие. Применение ЭРГ для оценки глазной фармакокинетики нейроретинопротекторов позволит упростить процедуру этих исследований.

Литература:

1. Егоров Е.А, Алексеев В.Н., Мартынова Е.Б., Харьковский А.О. «Патогенетические аспекты лечения первичной открытоугольной глаукомы», М. 2001.

2. Нестеров А.П. «Глаукома», М. Медицина, 1995.

3. Collington–Branch J./ Current Eye Reseach, vol.11, №1, 1992, p 1–3.

4. Data on file: 1985 Betaxolol NDA, p. 19–270.

5. Havener W. H. «Ocular pharmacology», 1974.

6. Marvin L.S.. «Pharmacology of the Eye» , 1985

7. Messmer C. end all / Am. J. Ophthalmol. 72, dec. 1991, p. 678–681.

8. Osborne N.N. end all / Exper. Eye res., 1999, vol. 69, № 3, p. 331–342.

9. Zimmerman T.J., Kooner K.S., Sharir M., Fechtner R.D. «Textbook of ocular pharmacology», 1997.

Опубликовано с разрешения администрации  Русского Медицинского Журнала.