Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака

В.В. Кешелава
ФГУ РНЦРР Росздрава, Москва

За последние годы в онкологии сделано многое. Прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенными достижениями в молекулярной биологии, иммунологии, развитии методов иммунотерапии, из которых наиболее перспективным представляется создание противоопухолевых вакцин, в частности на основе цельных опухолевых клеток (аутологичных и аллогенных), аутологичных белков теплового шока, вируса болезни Ньюкасла (ВБН) [1, 2, 7, 8].

В клинической онкологии накоплен большой опыт использования противоопухолевых вакцин, их эффективность доказана во многих клиниках мира. При этом разработаны и общепризнаны методы получения противоопухолевых вакцин и определено их место в профилактике и лечении рака [2, 3, 5, 7, 8].

Клетки опухолей пациента, полученные при операции или биопсии, широко используются в мировой онкологической практике для создания индивидуальных иммунотерапевтических препаратов. Основная задача такой терапии – повышение иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью химической обработки – гаптенизации, генетической модификации – трансфекции генов, которые кодируют стимулирующие иммунитет молекулы, и вирусной модификации. Последний подход рассматривается в качестве наиболее технологичного при использовании вируса, селективно заражающего опухолевые клетки. Таковым является вирус болезни Ньюкасла – псевдочумы птиц, точнее, его вакцинные штаммы – генетически стабильные, апатогенные для млекопитающих, применяемые в живых вирусных препаратах, повсеместно используемых для профилактики заболевания у кур. Преимущественное размножение данного вируса в опухолевых клетках млекопитающих было продемонстрировано более 40 лет назад. С этого времени большим количеством экспериментов на опухолях животных доказаны безвредность ВБН для млекопитающих и его достаточно высокая терапевтическая эффективность, особенно в случае сочетания онколитического и иммунизирующего действия зараженных вирусом опухолевых клеток.

Существует множество различных штаммов ВБН, все они классифицированы как литические (лизирующие клетки – МТН-68, 73-Т, Roakin, PV701) и нелитические (Ульстер).

Штаммы ВБН – литические и нелитические – изучались как противораковые агенты для человеческих клеток [4 – 8]. Исследователи при этом предполагают три клеточных механизма взаимодействия: первый – литические штаммы вируса напрямую уничтожают опухоли; второй – с помощью нелитических штаммов белки вируса проникают в мембрану опухолевых клеток, вызывая иммунную реакцию. И наконец, сам вирус может стимулировать организм носителя на вырабатку цитокинов: интерферонов и фактора некроза опухоли (TNF), что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток.

Вместе с тем есть много вопросов, касающихся клеточного механизма взаимодействия вируса с организмом. Не совсем ясно, какой из штаммов более эффективен, а также – что эффективнее: собственные опухолевые клетки пациента или опухолевые клеточные линии.

Экспериментальные исследования на животных показали, что ВБН и зараженные ВБН раковые клетки могут стимулировать большое разнообразие иммунных ответов. Это может способствовать успешной терапии рака. Доказано: ВБН безопасен для организма человека, лечение считается безвредным. Эффективность метода в той или иной мере подтверждена клиническими наблюдениями (в США, Европе и Китае) на пациентах с различными злокачественными новообразованиями (II – III фазы испытаний). Представлены результаты исследований использования онколизатов (штамм ВБН 73-Т для лечения метастатической меланомы, а так же рака почки, молочной железы и яичников), цельноклеточных вакцин (штамм ВБН Ульстер для лечения, колоректального рака, рака яичников почки, шейки матки) и заражения пациентов литическим штаммом ВБН МТН-68 для лечения, в частности, рака толстой кишки, желудка, поджелудочной железы, легких [ 6 – 8]. Во всех случаях отмечен положительный эффект применения как чисто вирусной терапии, так и аутологичной вакцинации вирус-модифицированными опухолевыми клетками. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время проходят завершающую, III фазу клинических испытаний, и, по мнению многих исследователей, уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом в комплексном лечении рака [4– 8].

Нами проанализированы опубликованные результаты о возможностях вакцинотерапии, обобщен опыт работы общепризнанных специалистов и с 2003 года начаты экспериментальные и клинические исследования по данной проблеме в рамках существующих медицинских норм клинических испытаний.

Была поставлена задача оптимизации и совершенствования имеющихся технологий получения аутологичных и модифицированных ВБН-вакцин, а также онколитического ВБН для использования у пациентов с различными злокачественными заболеваниями.

Применяемый нами апатогеный штамм Ла-Сота вируса болезни Ньюкасла (живая вакцина для птиц) выращивается в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах.

Для внесения в человеческие опухолевые клетки и инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Препарат при необходимости может быть лиофилизован, сохраняя при этом свои свойства в течение года.

Для приготовления аутологичной вакцины используют опухолевые клетки, выделенные непосредственно в ходе удаления опухоли. Технология приготовления вакцины общеизвестна и предполагает дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, облучение клеток с целью блокады их пролиферативной активности и различные приемы модификации для повышения ее эффективности. Этап создания культуры опухолевых клеток – сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo. Разработанные и применяемые нами оригинальные технологии выделения и культивирования клеток позволяют получить пролиферирующие первичные культуры более чем в 70% случаев для таких опухолей, как меланома кожи, рак почки, толстой кишки, яичников и молочной железы, а клеточные линии – по крайней мере в 50% случаев.

Не менее специфичной в процессе приготовления клеточных вакцин является необходимость инактивировать их способность к размножению с одновременным сохранением метаболической активности и повышения иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью вирусной модификации. На данном этапе клетки инактивировали гамма-излучением (дозы облучения подбирали индивидуально), замораживали в жидком азоте и использовали для вакцинации в дозах 10 – 50 млн после обработки 10 – 100 ID50 вируса (ВБН) на клетку.

Более специфическую аутовакцину получали из размножающихся in vitro клеток – перевиваемых опухолевых линий.

Такие линии клеток могут быть получены из операционного или биопсийного материала и способны размножаться бесконечно долго, обеспечивая необходимое для вакцинации количество гомогенных опухолевых клеток. Эти линии клеток также замораживали, инактивировали гамма-излучением и обрабатывали вирусом перед введением пациентам.

Известно, что принцип действия противоопухолевых вакцин основан на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в природе иммунитета здорового человека. Недостаточность противоопухолевого иммунитета обусловлена растущей опухолью и/или прогрессированием с возникновением множества метастазов и иммунодепрессивным эффектом противоопухолевой химиотерапии и облучения.

Усиление эффективности противоопухолевых вакцин путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов достигалось нами путем модификации вакцины непатогенным вирусом (ВБН) и использования человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основное биологическое действие Г-КСФ – гемопоэтическое, главным образом нейтрофилопоэтическое. Его введение в организм приводит к увеличению содержания в крови функционально активных нейтрофилов. Кроме этого, препарат повышает биохимическую (синтез протеаз), фагоцитарную, хемотаксическую активность, усиливает в организме синтез других цитокинов (интерферонов, трансформирующего фактора роста β и др.). Тем самым активизируются различные неспецифические и специфические механизмы защиты организма.

Предварительная клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцинотерапии в сочетании с Г-КСФ, а также наличие клеточных линий, полученных на этапах создания вакцины, позволили пересмотреть принципы и подходы химиотерапии в данном комплексе лечения. Правильный подбор препаратов, избирательно действующих на опухолевые клетки, выбор оптимальной дозы, режима и способа применения дали возможность проводить курсы химиотерапии длительно, без каких-либо осложнений в течение всего курса вакцинотерапии.

Предполагая данную комплексную методику лечения рака, мы учитывали и слабые сторон аутовакцинации – результат зависит от индивидуальных особенностей противоопухолевого иммунитета, а опухоль характеризуется не только множественностью антигенов, но и повышенной мутационной активностью с дальнейшим усилением признаков злокачественности.

Проведенные медико-биологические исследования показали высокую эффективность предлагаемой модели патогенетической терапии и позволили с учетом принятых допустимых медицинских норм провести клинические испытания на определенной группе больных с различными злокачественными новообразованиями.

Цель данного исследования:

объективно оценить непосредственный эффект комплексного лечения и его продолжительность (время до прогрессирования заболевания, выживаемость, качество жизни больных с различной злокачественной патологией) при использовании как аутологичных, облученных вакцин, модифицированных ВБН (группа А), так и онколитического вируса ВБН в чистом виде (группа В).
Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии:

1. Гистологически верифицированный диагноз опухолевого очага.
2. Возраст старше 18 лет.
3. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%).
4. Отсутствие эффекта противоопухолевого лечения на фоне ранее проводимой терапии или наличие признаков прогрессирования после их проведения.
5. Возможность визуальной или инструментальной оценки динамики изменений.
6. Информированное согласие больного на участие в исследовании.

Критерии исключения:

1. Поражение центральной нервной системы.
2. Активный аутоиммунный процесс.
3. Возраст старше 70 лет.
4. Наличие с одной из перечисленных инфекций: HIV, HBV, HCV.
5. Инфекционные или тяжелые заболевания сердечно- сосудистой, нервной, дыхательной или эндокринной систем; беременность или лактация.
6. Нарушение функции печени и/или почек (билирубин > 1,5 х N, креатинин > 1,5 х N), показатели крови: лейкоциты < 2,5 х 109/л Hb < 90 г/л, лимфоциты < 1,0 х 109/л, тромбоциты < 75 х 109/л).

В 2004 – 2006 годах в межклиническое проспективное нерандомизированное исследование эффективности и токсичности используемых вакцин было включено 46 больных с диагнозами:– «меланома кожи» (9 чел.), «рак молочной железы» (21), – «рак толстой кишки» (7), «рак шейки матки» (5), «рак яичников» (1), «увеальная меланома» (2) и «меланома влагалища» (1 чел.). Средний возраст пациентов составил 54,2 года.

Больным из обеих групп вакцину в сочетании с Г-КСФ вводили под/внутрикожно раз в неделю в течение 4-х недель начиная с 4-й по 8-ю недели после операции. В последующем курс продолжали аналогичными инъекциями раз в 2 недели в течение года, далее инъекции делали с возрастающим до 3-х месяцев интервалом на протяжении 1,5 года.

При проведении комбинированного лечения с включением курсов адъювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течение 6 месяцев лечения 29 больных получили аутологичную, облученную вакцину, модифицированную ВБН (от 8 до 16 внутрикожных введений), а 17 больных – онколитический вирус болезни Ньюкасла (до 16 внутрикожных введений) также при 6-месячном курсе лечения.
Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей, резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов, поражающих не один орган.

Следует отметить, что всем больным (46 человек) проведены полный курс комплексной терапии рака и в последующем – поддерживающая вакцинотерапия в течение 9 месяцев и более (амбулаторно).

В настоящее время все пациенты находятся в процессе лечебной или профилактической вакцинотерапии и динамического наблюдения с мониторингом основных жизненных параметров.

Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированной вирусом болезни Ньюкасла вакцины (группа А) и использования онколитического вируса болезни Ньюкасла в чистом виде (группа В) представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированной вирусом болезни Ньюкасла вакцины

Таблица 2. Результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла

*Критерии лечебного эффекта согласно шкале RECIST:
ПО - Полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов на срок не менее 4-х недель.
ЧО - Частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30% и более.
СТ - стабилизация: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование.
ПР - прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага.

Клинические и лабораторные исследования в обеих группах показали, что методы вакцинотерапии нетоксичны, хорошо переносились больными и сопровождались иммунологическим ответом у 42 больных, что подтверждено показателями периферической крови.

Большинство пациентов проходили курсы лечения амбулаторно. В течение всего процесса лечения больные вели обычный образ жизни. Каких-либо осложнений в процессе комплексной терапии не было отмечено. По завершении первого курса исчезала боль, уменьшались метастазы, больные отказывались от наркотических и обезболивающих средств, становились активнее, у них повышался аппетит, и они прибавляли в весе.

Отсутствие токсичности делало возможным применение данного метода лечения в течение года и более – до получения стойкого эффекта.

Результаты клинических исследований эффективности использования вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, в комплексной терапии рака в группах А и В (см. табл. 1, 2) показали следующее: лихорадка I и II степени наблюдалась практически у всех больных, она сопровождалась кратковременным ухудшением самочувствия, не требовала какого-либо лечения и в течение суток самостоятельно купировалась. Локальные кожные реакции в месте как первичного, так и повторных введений вакцины (гиперемия и локальный отек) стихали в течение нескольких дней и не требовали дополнительного лечения. Подобные симптомы традиционно наблюдаются при вакцинации. Возможные побочные эффекты при повторных вакцинациях в течение 4 – 5 суток после иммунизации вследствие выработки специфических антител (лихорадка, озноб, ощущение жара, кожная сыпь, увеличение лимфатических узлов) не были зарегистрированы ни разу.

Полный ответ на вакцинацию – исчезновение всех опухолевых очагов получен у 7 больных (15,2%). Из числа ответивших (см. табл. 1, группа А) у 5 пациентов (17,2%) был рак молочной железы (2 чел.) и толстой кишки (2 чел.), у 1 больной – меланома влагалища и у 2 (11,7%) – распространенный рак шейки матки (см. табл. 2). Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из ранее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печень, легкие, кости и лимфатические узлы отмечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5 – 6-м курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта в настоящее время составляет 9 месяцев (от 4-х до 16 месяцев).

Частичный ответ – уменьшение измеряемых очагов на 30% и более – наблюдался у 11 больных (23,9%). Как видно из таблицы 1 (группа А), 10 (34,5%) пациентов имели диагнозы: «меланома кожи» (2 чел.), «рак молочной железы» (6 чел.) и «рак толстой кишки» (2 чел.). В группе В (см. табл. 2) частичный регресс получен у 1 больной раком молочной железы (5,7%). Средняя продолжительность эффекта в обеих группах составляет 7,7 месяца.
Стабилизация опухолевого процесса (нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование) наблюдалась у 27 больных (58,7%). В группе А – 12 (41,3%) больных имели диагнозы: «меланома кожи» (5 чел.), «рак молочной железы» (4 чел.), «рак яичников» (1 чел.), «рак толстой кишки» (1 чел.) и увеальная меланома (2 чел.). Средняя продолжительность эффекта у данной группы больных – 7,7 месяца.

В группе В (см. табл. 2) стабилизация опухолевого процесса отмечена у 14 (82,3%) больных с диагнозами: «меланома кожи» (2 чел.), «рак молочной железы» (7 чел.), «рак толстой кишки» (2 чел.) и «рак шейки матки» (3 чел.). Средняя продолжительность эффекта – 6 месяцев.

Прогрессирование (увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага) наблюдалось в группе А у 2 больных (6,8%) с диагнозами «рак молочной железы» и «меланома кожи».
В таблице 3 суммированы критерии лечебного эффекта комплексной терапии больных со злокачественными опухолями в группах А и В.

Таблица 3. Критерии лечебного эффекта использования аутологичной, облученной и модифицированной ВБН вакцины (группа А) и онколитического ВБН (группа В) в комплексной терапии рака

Критерии эффекта по шкале RECIST Группа А: n* = 29, больные / % Группа В: n* = 17,

больные / % Полный ответ 5 / 17.,2 % 2 / 11.,7 % Частичный ответ 10 / 34,.5 % 1 / 5,.7 % Стабилизация 12 / 41,.3 % 14 / 82.,3 % Прогрессирование 2 / 6,.8 % 0 / 0 %

n – количество больных

Анализируя предварительные результаты комплексной терапии рака по данным, приведенным в таблице 3, можно сделать следующие выводы:

– вирус болезни Ньюкасла (апатогеный штамм Ла-Сота) по уровню эффективности и безопасности применения соответствует признанным стандартам специфической иммунотерапии опухолей;
– вакцинотерапия применима в качестве иммунологического адъюванта в комплексной терапии для лечения больных диссеминированными солидными опухолями;
– вирусная терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, нивелируя иммунодепрессивный эффект противоопухолевой химиотерапии и облучения, позволяет проводить комплексную терапию длительно и эффективно, без каких-либо осложнений в течение всего курса лечения;
– вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных ВБН; способны инициировать более выраженный специфический противоопухолевый (терапевтический) эффект в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде в комплексной терапии рака, что делает метод лечения – при его возможности использования – предпочтительным.

Анализ предварительных результатов на небольшом клиническом материале и малые сроки наблюдения за больными не позволяет найти ответы на множество актуальных вопросов, в частности: в какой степени видимый клинический успех можно отнести к вакцинации опухолевыми клетками, зараженными ВБН, или к чисто вирусной терапии у больных, получивших комплексное лечение?

Применение вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, в комплексном лечении рака может быть реально осуществлено на базе медицинских центров.

Экспериментальное производство препарата разработано и не требует относительно больших затрат. Области и схемы применения ВБН в онкологических клиниках отрабатываются в процессе клинических испытаний с учетом мирового опыта.

Результаты этих испытаний показали, что все виды клеточных вакцин обладают определенным иммунологическим и клиническим эффектом, повышающим качество жизни онкологических больных и улучшающим перспективы лечения. Перспективным представляется также проведение иммунотерапии вакцинами у больных после радикального лечения или циторедуктивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.
Вероятно, пройдет еще немало лет до начала широкого применения вакцинотерапии на практике. Однако результаты клинических и экспериментальных работ ученых в разных странах мира позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.

Есть все основания считать, что уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака.
Вместе с тем следует отметить, что хотя перспективность использования противоопухолевых вакцин в онкологии можно считать установленной, их внедрение в клиническую практику ограничивается высокой стоимостью, а также довольно сложной технологией изготовления, требующей высококвалифицированного персонала и соответствующего оснащения. Можно надеяться, что создание специализированных лабораторий клеточной медицины, разработка новых методов и совершенствование существующих технологий получения противоопухолевых вакцин позволят уже в ближайшее время использовать их в качестве доступного метода лечения широкого круга онкологических больных.

Литература

1. Гриневич Ю.А. Фильчаков Ф.В. Адаптивная иммунотерапия и ее влияние на эффективность лечения онкологического профиля // Онкология. 2003. Т. 5. № 2. С. 90–95.
2. Хансон К.П., Моисеенко В.М. Биотерапия злокачественных новообразований // Проблемы клинической медицины. № 3. 2005. С. 10–15.
3. Steiner, H.H., Bonsanto M.M., Beckhove P. et al. Antitumor vaccination of patients with glioblastoma multiforme: A pilot study to assess feasibility, safety and clinical Benefit. J Clin Oncol 2004; 22: 4272–4281.
4. Washburn B., Weigand M. A., Grosse-Wilde A. et al. TNF-related apoptosis-inducing ligand mediates tumoricidal activity of Human monocytes stimulated by newcastle disease virus. J Immunol 2003. 170: 1814–1821.
5. Pecora A.L., Rizvi N., Cohen G.I. et al. Phase i trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol. 2002; 20: 2251–2266.
6. Nakaya T., Cros J., Park M.-S., Nakaya Y et al. Recombinant newcastle disease dirus as a vaccine vector. J. Virol. 2001; 75: 11868–11873.
7. Csatary L.K., Csatary E., Moss R.W. Re: Scientific interest in newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 493–493.
8. Nelson N.J. RESPONSE: Re: Scientific Interest in newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 493a–494 .

Статья опубликована в журнале "Эпидемиология и Вакцинопрофилактика" № 3 (34) за 2007 год
Публикуется с разрешения редакции журнала.